導讀

近日，Microbiol Spectr 雜志發(fā)表了一項初步研究，旨在探索 DNA 甲基化與結核潛伏感染（LTBI）人群活動性肺結核發(fā)生的關聯(lián)研究。該研究主要由中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所完成，研究采用巢式病例對照設計，回顧性檢測 LTBI 人群中發(fā)展為活動性肺結核者與未發(fā)病者 DNA 甲基化程度，探索 DNA 甲基化與 LTBI 人群發(fā)生活動性肺結核的關系，為尋找 LTBI 與活動性肺結核的鑒別診斷生物標志物提供新的思路。中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所的博士生杜瑩為文章的第一作者，高磊研究員與辛赫男副研究員為文章的通訊作者。

科學問題

針對 LTBI 高危人群開展預防性治療是直接降低發(fā)病率，實現(xiàn) 2035 年“END TB”全球戰(zhàn)略目標的重要手段。目前，肺結核的診斷仍然是以病原學（包括細菌學、分子生物學）檢測為主，存在敏感性低、周期長、易受痰標本質(zhì)量影響等問題。探索基于宿主血液的生物標志物用于診斷活動性肺結核一直是領域內(nèi)的研究熱點。DNA 甲基化是目前研究比較廣泛的表觀遺傳方式，本研究以此為切入點，探索 DNA 甲基化與活動性肺結核發(fā)生的關系。

實驗設計

樣本： 外周血 PBMC

分組： 分別收集基線及隨訪時的自身前后兩份外周血樣本進行分子標識研究?；€時共 1155 例未進行預防性治療的結核潛伏感染者參與了該研究，通過 5 年隨訪，共有 26 例研究對象發(fā)展為活動性肺結核，從中選擇有足夠外周血單核細胞的 15 例調(diào)查對象作為病例組，并根據(jù)年齡、性別匹配了 15 例未發(fā)生活動性肺結核的調(diào)查對象作為對照組。

技術：850K 甲基化芯片（伯豪提供）

實驗思路

實驗結論

1. 調(diào)查對象基本信息

對 30 例研究對象的自身前后兩份樣本共 60 份樣本進行了 850K 芯片篩選，其中包括 15 例結核病患者（11 例病原學確診病例及 4 例臨床確診病例）和 15 例年齡、性別匹配的結核潛伏感染對照組。30 例調(diào)查對象的年齡中位數(shù)為 65（62，68）歲，以男性居多（73.33%，22/30）。兩組的 IFN- γ 釋放水平、吸煙和飲酒間差異無統(tǒng)計學意義，其中，病例組的 BMI 低于對照組（P=0.025），但均在正常范圍內(nèi)。

▲表 1   LTBI 人群隊列信息特征

2. 甲基化芯片篩選結果

850K 芯片對每例參與者的自身前后兩份樣本進行檢測并評估全基因組 DNA 甲基化程度。共分析了 60 份血液樣本中 86 萬多個 CpG 位點的甲基化狀態(tài)。在研究終點，病例組和對照組之間有 2826 個顯著差異甲基化位點，在病例組自身前后，共有 78110 個顯著差異甲基化位點。為了達到在結核潛伏感染人群中鑒別診斷活動性肺結核的目的，作者選擇研究終點時病例組和對照組之間的差異甲基化位點，并且同時滿足病例組自身前后甲基化程度發(fā)生改變，對照組自身前后甲基化差異沒有統(tǒng)計學意義，共得到 134 個甲基化位點作為候選分子標識。

為了進一步分析隨訪期間病例組和對照組之間的 2826 個 dmCpGs 所在基因的生物學功能，進行 GO 和 KEGG 富集分析。通過 GO 功能分析，結果表明，dmCpGs 主要富集于胰島素分泌的生物過程中，涉及對葡萄糖刺激的細胞反應、涉及吞噬作用的 Fc- γ 受體信號傳導途徑和鈣離子螯合的調(diào)節(jié)。KEGG 分類結果表明，這些 dmCpGs 主要富集在細菌感染性疾病和癌癥中。

圖 2   富集分析結果

在 134 個差異甲基化位點中，選擇位于 TSS 置 200bp 或者 TSS1500bp 的位點，共得到 8 個候選甲基化位點做進一步分析，其中 6 個位點為高甲基化狀態(tài)，2 個位點為低甲基化狀態(tài)。

3. 差異甲基化的診斷效能

8 個 dmCpGs 的 AUC 在 0.72 ~ 0.84 之間。其中，位于 SIRT1 基因 CPG 島啟動子區(qū)的 cg12159502 位點呈現(xiàn)佳 AUC，為 0.84)，敏感度為 73.33%，特異度為 86.67%。按照 WHO 的 TPP 準則，對于給定的 93.33% 的敏感度，cg14593639 的特異度高，為 66.67%。

表 2 8 個位點的區(qū)分能力評價

隨后，作者計算了 8 個 dmCPGs 不同組合形式的診斷效能。共有 247 個不同的組合），有 52 個組合的診斷效能符合世界衛(wèi)生組織 TPP 基準。其中，“SIRT1+SIRT5+GNB2L1+FLJ44635”組合表現(xiàn)佳，敏感度為 93.33%，特異度為 86.67%。

表 3 8 個位點的區(qū)分能力評價

初步結果提示，SIRT1 等基因 CPG 島啟動子區(qū) DNA 高甲基化可能作為在 LTBI 人群中鑒別活動性肺結核的生物標志物，在 LTBI 高危人群中進行系統(tǒng)篩查不僅可以實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)病人，還可以快速的鑒別出活動性肺結核患者并盡早對其開展預防性治療?？紤]到亞臨床結核和病原學陰性的肺結核患者，與基于痰液樣本的檢測方法相比，基于血液的生物標志物可大大提高診斷敏感性及時效性。鑒于納入研究樣本量有限，本研究結果尚需在大樣本的獨立人群中進一步驗證。

參考文獻

Du Y, Gao X, Yan J, et al. Relationship between DNA Methylation Profiles and Active Tuberculosis Development from Latent Infection: a Pilot Study in Nested Case-Control Design. Microbiol Spectr, 2022 Apr 21:e0058622. doi: 10.1128/spectrum.00586-22

來源：中國防癆雜志期刊社